今日拓普小編為您分享酵母提取物酵母甘露寡糖對圍產(chǎn)期奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

 奶牛圍產(chǎn)期是奶牛生理上的劇變時期，能量需要量急劇增加。但是，由于產(chǎn)犢應(yīng)激和妊娠期瘤胃體積的壓縮，采食量遲遲不能恢復(fù)，無法滿足能量需要而出現(xiàn)能量負平衡現(xiàn)象（NEB）。在NEB狀態(tài)下，奶牛的機體代謝發(fā)生變化，影響奶牛對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用，終導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能下降。NEB還會增加體脂動員，導(dǎo)致肝臟中非酯化脂肪酸（NEFA）蓄積，引起脂肪肝和酮病等營養(yǎng)代謝病。近年來，研究人員不斷尋求緩解圍產(chǎn)期奶牛NEB的策略。

　　甘露寡糖（MOS）是一種功能性寡糖，能夠提高畜禽的生產(chǎn)性能，有改善反芻動物免疫性能、緩解能量負平衡的潛力，但其作用機理尚不明確。在高產(chǎn)奶牛的研究中發(fā)現(xiàn)，MOS能夠通過提高泌乳期奶牛瘤胃中纖維降解菌的相對豐度、促進纖維降解、提高瘤胃乙酸產(chǎn)量；還能通過降低乳酸產(chǎn)生菌豐度、提高乳酸利用菌豐度減少瘤胃的乳酸蓄積，穩(wěn)定瘤胃pH值。由于圍產(chǎn)期日糧與高產(chǎn)奶牛的不同以及機體代謝活動的巨大差異，其瘤胃微生物區(qū)系與發(fā)酵模式與高產(chǎn)奶牛均有較大差異。生產(chǎn)上也缺乏圍產(chǎn)期奶牛MOS適宜添加劑量的研究。因此，試驗研究在圍產(chǎn)期奶牛飼糧中添加不同劑量MOS對圍產(chǎn)期奶牛瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物菌群的影響。探索通過調(diào)控瘤胃代謝以緩解圍產(chǎn)期奶牛NEB的途徑，并嘗試尋找圍產(chǎn)期奶牛飼糧中添加的適宜濃度。

1、材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與試驗動物

　　取胎次（1.9±0.7）胎、體況評分3.43±0.24、上一泌乳周期產(chǎn)奶量及預(yù)產(chǎn)日期相近的干奶前期荷斯坦奶牛60頭，按照隨機區(qū)組試驗設(shè)計方法，分為4組（C、L、M和H組），每組15頭。C組奶牛飼喂基礎(chǔ)飼糧，L、M和H組分別在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加5、10和15 g/（頭d）MOS（奧特奇公司生產(chǎn)）。每天早上投料后，立刻將相應(yīng)劑量的MOS撒在對應(yīng)的奶牛飼料表面，確保添加的MOS被全部攝入。試驗期為預(yù)產(chǎn)期前21d至產(chǎn)后21d停止飼喂。試驗?zāi)膛Ｔ诋a(chǎn)前飼喂圍產(chǎn)前期飼糧，圍產(chǎn)前期基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。每天分別于7：00和18：00飼喂2次。產(chǎn)后飼喂圍產(chǎn)后期基礎(chǔ)飼糧，圍產(chǎn)后期基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。每天分別于6：30、14：30和19：30飼喂3次。試驗期間自由飲水。產(chǎn)后1~7 d之內(nèi)，每天分別于6：00和14：00擠奶2次；產(chǎn)后7~21d之內(nèi)，每天分別于6：00、14：00和19：00擠奶3次。

表 1 圍產(chǎn)前期基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 圍產(chǎn)后期基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

圖片蛋白（MCP）；第二份低溫離心機中10000×g離心10min，取3.0 mL上清液，加入0.3mL偏磷酸，搖勻，靜置30min，10000×g低溫離心15 min，取上清，用以測定VFA；第三份置于紗布袋中，投入液氮罐內(nèi)運回實驗室，-80℃保存，以待用16S rDNA高通量測序分析技術(shù)檢測瘤胃液微生物菌群。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的測定

　　采用差速離心法和凱氏定氮法測定瘤胃液的MCP。計算公式如下：X=[(V1-V2)×N×0.014/(V×10/100)]×6.25×100%  (1)式中：X為樣品中蛋白質(zhì)的百分含量；V1為樣品消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積（mL）；V2 為空白對照消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積（mL）；N為硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的當(dāng)量濃度；V為樣品的體積（mL）。利用Agilent 7890A氣相色譜檢測儀采用外標(biāo)分析法測定瘤胃液VFA。

1.3.2 瘤胃微生物菌群的測定

　　采用SDS方法提取樣本的基因組DNA，將稀釋過的基因組DNA作為模板，選擇16S V4區(qū)作為擴增區(qū)域，使用New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer以及保真酶，選擇帶Barcode的515F-806R作為特異性引物，用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收目的條帶。

　　使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒進行構(gòu)建基因組文庫。之后用 Qubit 和 Q-PCR 定量檢測構(gòu)建好的基因組文庫，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。測序服務(wù)由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

　　數(shù)據(jù)采用SAS 9.4的MIXED模型進行分析，用PDIFF校正的Tukey模型進行多重比較。用 Contrast 語句對NCG劑量的線性、二次和三次效應(yīng)進行評估。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用Pearson方法對試驗數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。P<0.05為組間差異顯著，0.05<P<0.10為組間差異有趨勢。

2、結(jié)果與分析

2.1 MOS對產(chǎn)后21d奶牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響（見表3）

表3 MOS對產(chǎn)后21 d奶牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

　　由表3可知，隨著MOS添加量的增加，奶牛產(chǎn)后21d瘤胃液中微生物蛋白含量、總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸、丙酸、丁酸和異丁酸的濃度和乙丙比均線性上升（P<0.05）。

2.2 MOS對產(chǎn)后21d奶牛瘤胃微生物OTUs數(shù)量的影響（見圖 1）

　　用Uparse軟件對所有樣本Tags進行聚類，以97%一致性聚類為OTUs。

　　由圖1可知，C、L、M和H組OTUs數(shù)分別為2196、2156、2204和2063，4組樣本OTUs相似度較高，有1741個OTUs為4組共有。

2.3 MOS對產(chǎn)后21d奶牛瘤胃微生物Alpha多樣性的影響（見表4）

表4 MOS對產(chǎn)后21d奶牛瘤胃微生物Alpha多樣性的影響

　　由表4可知，各組樣本間Alpha多樣性指標(biāo)均差異不顯著（P>0.05）。

2.4 MOS對產(chǎn)后21d奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響（見表5、表6）

表5 MOS對產(chǎn)后21d奶牛瘤胃微生物門水平菌群結(jié)構(gòu)的影響

表6 MOS對產(chǎn)后21d奶牛瘤胃微生物屬水平菌群結(jié)構(gòu)的影響

　　由表5可知，4組樣品共涉及11個門，各組相對豐度高的菌群均為擬桿菌門 （Bacteroidetes），此后依次是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）。這3類菌占各組菌群相對豐度的90%以上。雖然MOS處理對大部分菌門均無顯著影響，但是隨著 MOS添加量的增加，厚壁菌門和藍藻菌門相對豐度呈線性下降（P<0.01），纖維桿菌門具有二次上升趨勢（P<0.10），淋溶菌門 （Elusimicrobia） 相對豐度線性上升 （P<0.05）。

　　由表6可知，在豐度前10的屬中，隨著MOS添加量的提高，除毛螺菌屬呈現(xiàn)線性下降的趨勢（P<0.10），纖維桿菌屬呈現(xiàn)二次變化的趨勢（P<0.10）外，其余各屬均無顯著變化（P>0.05）。

2.5 部分瘤胃液菌群與MOS及瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的相關(guān)性（見表7）

表7 部分瘤胃液菌群與MOS及瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的相關(guān)性

　　由表7可知，20個樣品中檢測到147個屬，11個屬與MOS添加量顯著相關(guān)，8個屬顯著負相關(guān)，3個屬顯著正相關(guān)。11個屬主要來自厚壁菌門（Firmicutes）（9/11），其余來自放線菌門（Actinobacteria）和淋溶菌門（Elusimicrobia）。瘤胃梭菌屬1豐度的變化與瘤胃乙酸、異丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸、微生物蛋白以及丁酸含量呈顯著正相關(guān)。隨著MOS添加量的升高，高夫羅瘤胃球菌屬（Ruminococcus gauvreauii）、蒜頭藻屬（Allisonella）、溶纖維真桿菌屬（Eubacterium cellulosolvens）、Shuttleworthia以及梭狀芽孢桿菌屬1（Lachnoclostridium 1）等菌屬豐度下降。其中，Allisonella、Lachnoclostridium 1 與乙酸、丁酸以及TVFA含量顯著負相關(guān)；Ruminococcus gauvreauii與乙酸、TVFA含量顯著負相關(guān)，與丙酸含量極顯著負相關(guān)；Shuttleworthia與乙酸、丁酸含量顯著負相關(guān)，與TVFA含量極顯著負相關(guān)。

３、討論

　　本試驗中，隨著MOS添加量的增加，瘤胃液中微生物蛋白與乙酸的含量均顯著升高。研究表明，飼糧中添加外源性MOS能夠改善瘤胃發(fā)酵，提高瘤胃液微生物蛋白與乙酸的含量。也有研究發(fā)現(xiàn)，MOS對于綿羊體外瘤胃發(fā)酵指標(biāo)均未產(chǎn)生顯著影響。結(jié)果不同可能與所用飼糧結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。陳志龍等研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊體外瘤胃發(fā)酵中，MOS添加量與飼糧精粗比之間存在交互作用。本試驗前期采用低能量水平飼糧，后期換用高能量水平飼糧，飼糧結(jié)構(gòu)的變化會導(dǎo)致瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生變化。而MOS對于瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響則主要是通過調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系而實現(xiàn)。本試驗中，盡管微生物蛋白和瘤胃發(fā)酵指標(biāo)出現(xiàn)顯著變化，但瘤胃液菌群Alpha多樣性無顯著差異，與郭婷婷等的研究結(jié)果一致，可能是因為MOS調(diào)控發(fā)酵主要是通過調(diào)節(jié)瘤胃液微生物的菌群結(jié)構(gòu)而非多樣性來實現(xiàn)的。

　　在不同能量水平下，MOS對于瘤胃微生物菌群相對豐度的影響不盡相同。MOS能夠極顯著降低高產(chǎn)奶牛瘤胃液中藍藻門（Cyanobacteria）細菌的相對豐度，對厚壁菌門及纖維桿菌門豐度無顯著影響，但對于高精料誘導(dǎo)下的低乳脂奶牛而言，MOS對瘤胃液中藍藻門細菌的相對豐度無顯著影響，卻顯著提高厚壁菌門、纖維桿菌門細菌的豐度。厚壁菌門與纖維桿菌門細菌是牛瘤胃中較為主要的菌群，可以產(chǎn)生大量纖維素酶。研究表明，外源添加MOS能夠提高奶牛瘤胃中纖維素降解菌的活性和數(shù)量，有可能是通過提高厚壁菌門、纖維桿菌門細菌的相對豐度而實現(xiàn)的。本試驗中，纖維降解菌的相對豐度隨著外源性MOS添加量的提高而升高，從而提高對日糧的纖維降解率，與瘤胃中乙酸濃度的提高相一致。

　　根據(jù)瘤胃液中出現(xiàn)顯著變化的菌屬與瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的相關(guān)性分析，MOS添加量與Ruminococcus gauvreauii、Allisonella、Eubacterium cellulosolvens、Shuttleworthia以及Lachnoclostridium 1等厚壁菌門菌屬有較強的負相關(guān)性。Eubacterium cellulosolvens可以產(chǎn)生纖維素酶分解纖維素，然而其纖維素分解活性受到碳水化合物的抑制，這種效應(yīng)被稱為碳分解代謝抑制。Eubacterium cellulosolvens的許多菌種僅能利用纖維素或纖維二糖作為分解底物。當(dāng)?shù)矸鄣瓤扇苄蕴妓衔锖枯^高時，其對于纖維素的分解能力會受到碳分解代謝抑制的影響。本試驗中，由于添加MOS，能夠促進纖維素的分解，提高瘤胃液中碳水化合物的水平，因此，Eubacterium cellulosolvens與MOS添加量呈現(xiàn)顯著負相關(guān)。動物消化道中的Ruminococcus gauvreauii、Shuttleworthia與Lachnoclostridium 1或許與疾病的發(fā)生有關(guān)。Ruminococcus gauvreauii是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性球菌，在患糖尿病大鼠腸道中相對豐度顯著提高；在限制飲水的條件下，Shuttleworthia在紹興鴨后腸道中的相對豐度顯著上升；而Lachnoclostridium 1則可作為標(biāo)記物，用以診斷內(nèi)源性大腸腺瘤和癌癥的發(fā)生。添加MOS降低了瘤胃液中Shuttleworthia與Lachnoclostridium 1的豐度，可能是因為MOS能夠提高動物免疫性能。瘤胃液中組胺含量過高會導(dǎo)致mTOR自噬通路受到抑制，清除有害物質(zhì)的功能減弱，引起細胞損傷。組胺往往 通過組氨酸脫羧形成，然而，Allisonella在不分解組氨酸的情況下也能夠產(chǎn)生組胺。MOS降低Allisonella豐度，有利于減少組胺的產(chǎn)生，促進有害物質(zhì)的清除。此外，MOS還可能通過增加Ruminiclostridium 1的相對豐度提高VFA的含量，因為該菌屬與乙酸、異丁酸以及TVFA 含量均有顯著正相關(guān)性。纖維素在瘤胃內(nèi)往往先被纖維分解菌分解為纖維二糖和纖維糊精，Ruminiclostridium 1是一種，其可以產(chǎn)生纖維二糖磷酸化酶以及纖維糊精磷酸化酶，進一步分解纖維二糖和纖維糊精。

４、結(jié)論

圍產(chǎn)期飼糧中添加MOS雖然對瘤胃微生物的Alpha多樣性影響不顯著，但是顯著提高瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙丙比和微生物蛋白水平，促進瘤胃發(fā)酵。相關(guān)性分析表明，MOS添加對瘤胃發(fā)酵的促進作用可能主要是通過調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)、促進纖維分解、降低疾病相關(guān)細菌豐度、改善瘤胃健康實現(xiàn)的。圍產(chǎn)期奶牛日糧中MOS的添加量為15 g/（頭·d）

                                                                                                                                                                                          ——摘自《反芻動物營養(yǎng)》No.04 2021